Cari Blog Ini

Jumat, 16 November 2012

“Preparat Paraffin Hewan Irisan Organ”




I.                   PENDAHULUAN

A.    Latar Belakang


            Mikroteknik adalah ilmu yang mempelajari tentang pembuatan preparat. Dalam setiap pembuatan preparat pada umumnya selalu dilakukan fiksasi terlebih dahulu. Sedangkan fiksasi itu sendiri adalah suatu cara atau proses (metode) yang bertujuan untuk mematikan sel tanpa mengubah fungsi dan struktur di dalam sel itu sendiri. Jika telah dilakukan fiksasi maka preparat yang dibuat akan menjadi lebih awet dan tahan lama.
Dalam tubuh hewan terdiri dari berbagai penyusun tubuh, salah satunya adalah organ. 
Organ merupakan bagian tubuh yang memiliki satu atau lebih fungsi tertentu. Penyusun organ adalah beberapa jenis jaringan yang terorganisir dan saling berkaitan satu dengan yang lainnya. Contoh: usus halus, berfungsi mencerna dan menyerap sari-sari makanan. Struktur usus halus terdiri dari jaringan otot, jaringan epitel, jaringan ikat, dan jaringan saraf. Sedangkan Sistem organ merupakan gabungan dari berbagai organ yang melaksanakan satu fungsi dalam koordinasi tertentu. Pembesaran dan diferensiasi sel-sel terorganisasi menjadi jaringan dan kumpulan jaringan membentuk organ-organ, selanjutnya kumpulan oragan membentuk sistem organ dan menjadi tubuh.
Metode pembuatan sediaan dengan penyelubungan parafin disebut juga sebagai metodeembedding. Pembuatan sediaan dengan pemotongan jaringan menggunakan parafin dan mikrotom sebagai alat pemotongnya. Kelebihan metode ini adalah irisannya jauh lebih tipis dan prosedurnya juga lebih cepat jika dibandingkan dengan metode seliondin maupun metode beku. Alat pemotong mikrotom yang digunakan bekerja berdasarkan suatu ulir yang berfungsi untuk mendorong maju blok preparat atau pisau. Pembiusan merupakan proses yang bertujuan khusus untuk preparat hewan yaitu untuk memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada hewan.
Pembiusan tidak perlu dilakukan jika yang akan diambil atau diamati adalah jaringan yang menyangkut kelenjar-kelenjar (endokrinologi), karena mungkin akan berpengaruh terhadap hormon-hormon yang terkandung di dalamnya. Senyawa kimia yang umumnya digunakan untuk pembiusan adalah:
1. Eter, biasanya digunakan untuk membius tikus, kelinci, marmut, dan anjing
2. Kloroform, biasanya digunakan untuk membius kucing dan kera.
Senyawa kimia lainnya yang dapat digunakan untuk pembiusan adalah prokain, aseton- CHCl3, Morfin HCl, methane, alcohol, klereton, kloral hidrat, kokain, dan garam magnesium.
Olehnya pada praktikum ini akan dilakukan pengamatan dari beberapa organ hewan dengan menggunakan metode praparat paraffin.


B. Tujuan Praktikum
    Tujuan yang ingin dicapai pada praktikum ini yaitu  sebagai berikut :
  1. Untuk membuat preparat organ tubuh HEWAN berupa irisan tipis organ/ bagian organ  tersebut.
  2. Untuk mengamati struktur dalam sel maupun jaringan penyusunnya.


C.  Manfaat Praktikum
         Manfaat yang dapat diperoleh dari pelaksanaan praktikum ini yaitu :
  1. Dapat membuat preparat organ tubuh hewan berupa irisan tipis organ/ bagian organ  tersebut.
  2. Dapat mengamati struktur dalam sel maupun jaringan penyusunnya.

II  TINJAUAN PUSTAKA

        Metode parafin adalah suatu cara pembutan sediaan baik itu tumbuhan ataupun hewan dengan menggunakan parafin. Kebaikan-kebaikan metode ini ialah irisan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mkron, tapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Kelemahan dari metode ini ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim yang terdapat pada jaringan akan larut dengan menggunakan metode ini    (Santoso, 2002).
       Jaringan hewan dapat dibagi menjadi empat kelompok berdasarkan fungsi dan strukturnya, yaitu jaringan epitel, jaringan pengikat, jaringan otot dan jaringan syaraf. Jaringan epitel terdiri dari sekumpulan sel yang sangat rapat susunannya sehingga membentuk suatu lembaran, tidak mempunyai substansi interseluler dan cairannya sangat sedikit. Jaringan pengikat (connective tissue) terdiri dari bermacam-macam sel, terdapat substrat interseluler dan berasal dari jaringan mereskim. Ada beberapa jaringan pengikat, salah satunya adalah jaringan hemopoitik (jaringan darah), merupakan suspensi sel dan fragmen sitoplasma di dalam cairan yang disebut plasma darah. Jaringan otot merupakan jaringan yang mampu melangsungkan kerja mekanik dengan jalan kontraksi dan relaksasi sel atau serabutnya. Berdasarkan struktur dan fungsinya, jaringan otot dibedakan menjadi tiga jenis, yaitu otot polos, otot lurik dan otot jantung. Jaringan syaraf merupakan jaringan dasar yang terdapat hampir di seluruh jaringan tubuh sebagai jaringan komunikasi (Kimball, 1992).
         Preparat jaringan hewan dan tumbuhan dapat diperiksa dibawah mikroskop apabila sudah terlihat warna yang kontrase baik maka diberi canada balsam lalu ditutup dengan kaca penutup, dan terakhir diberi label preparat permanen tersebut. Dikarenakan keterbatasan waktu dan tidak adanya mikrotom yang baik di laboratorium maka pekerjaan tidak bisa sampai selesai. Karena metode parafin sekarang lebih banyak digunakan di laboratorium- laboratorium, maka dengan sendirinya mikrotom jenis ini lebih banyak digunakan daripada mikrotom-mikrotom lainnya. Hal ini disebabkan karena irisan yang diperoleh lebih tipis dibandingkan dengan metode lainnya (Rina, 2010).
         Darah adalah cairan yang terdapatpada semua hewan tingkat tinggi yang fungsinys mengirimkan zat-zat dan oksigen yang dibutuhkan oleh jaringan tubuh , mengangkut bahan kimia hasil metabolisme dan juga sebagai pertahan dari serangan virus atau bakteri. Istilah medis yang berkaitan dengan darah diawali dengan kata haemo atau hemato yang berasal dari bahasa yunani haima yang berarti darah. Sel darah merah dihasilkan dilimpa, hati dan sumsum merah tulang pipih, ( Perutz, 1978 ).
Ada 2 macam metode irisan adalah sebagai berikut :
      Metode irisan dengan tangan.
Pada beberapa macam jaringan, terutama dalam lapangan botani, pembuatan sediaan dengan cara ini masih dapat dipakai misalnya melihat susunan daun segar. Dengan mempelajari sediaan seperti ini dapat diperoleh beberapa keterangan mengenai luas maupun tipe fibrosis didalam jaringan yang patologis.
      Metode irisan dengan mikrotom.
      Di dalam metode ini sediaan didapat dari jaringan-jaringan pengirisannya menggunakan suatu alat yang disebut mikrotom. Keuntungan dari alat ini adalah bahwa tebal irisan dapat diatur menurut tajam dan kehendak peneliti. Macam-macam mikrotom diantaranya mikrotom geser, mikrotom beku, dan mikrotom putar (rotary mikrotom) (Mcmanus, 1992).


 III. METODE PRAKTIKUM

A.  Waktu dan Tempat
      Praktikum kali ini dilaksanakan pada hari Sabtu dan Minggu, pada tanggal 27-28 November 2011, pada pukul 09.00 WITA-selesai dan bertempat di Laboratorium Anatomi Tumbuhan Fakultas MIPA Universitas Haluoleo, Kendari.

B.  Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Alat-alat yang digunakan pada Praktikum Preparat Pollen.
No
Nama Alat
Fungsi
1

2

3
4
5
6
8
9

10
11
12
Botol film

Pinset

Skalpel
Mikrotom
Vakum
Kotak kertas kalender
Balok
Mikroskop

Kaca objek
/kaca penutup
Oven
Hotplate

Tempat untuk meletakkan organ.
Untuk mengambil organ yang sdh difiksasi.
Untuk membuat cetakan.
Untuk memotong paraffin.
Sebagai alat vakum.
Tempat organ yang akan dicetak.
Sebagai media penempelan paraffin.
Untuk mengamati/melihat objek hasil pemotongan.
Untuk mengamati organ tumbuhan.
Untuk memanaskan paraffin.
Untuk memanaskan paraffin.



Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini dapat dilihat pada Tabel 2.
Tabel 2. Bahan-bahan yang digunakan pada Praktikum Preparat Pollen.
No
Nama Bahan
Fungsi
1



2
3


4

5


6

Seekor kelinci jantan besar.



 FAA
 Alkohol, dengan berbagai konsentrasi
(50%, 60%, 70%, 80%, 90%, dan 95%)
 Xilol

 Parafin lunak dan keras
 
 
 Safranin
 



Sebagai sampel yang akan dibuat menjadi preparat untuk mengamati organ-organnya (jantung, usus, hati, ginjal).
Formalin Asam Asetat
Sebagai larutan fiksasi, Untuk mencuci/membersihkan sisa larutan fiksasi dan alkohol.
Sebagai larutan yang digunakan untuk memfiksasi.
Untuk membuat praparat paraffin dan sebagai media penanaman organ tumbuhan.
Untuk memberikan warna pada organ
.




C.  Prosedur Kerja
        Prosedur kerja yang dilakukan pada prakrikum kali ini adalah sebagai berikut:
  1. Fiksasi : bahan difiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA dengan komposisi :
Etanol 70% ……………………………. 90 bagian
Asam asetat glasial …………………..    5 bagian
Formaldehid …………………………..    5 bagian
  1. Pencucian : larutan fiksatif dibuang dan dicuci dengan etanol 70% sebanyak 2X dengan waktu penggantian masing-masing selama ½  jam.
  2. Dehidrasi : dilakukan secara bertahap dengan merendam bahan dalam seri larutan alkohol dengan waktu penggantian berturut-turut sebagai berikut :
Alkohol  70%     …………………………  ½ jam
Alkohol  95%     …………………………  ½ jam
Alkohol 100% I  …………………………  ½ jam
Alkohol 100% II …………………………  ½ jam
  1. Dealkoholisasi (penjernihan) : dilakukan secara bertahap pula melalui seri larutan alkohol – xilol dengan waktu penggantian berturut-turut sebagai berikut :
Alkohol/xilol 3 : 1 ……………………….  ½ jam
Alkohol/xilol 1 : 1 ……………………….  ½ jam
Alkohol/xilol 1 : 3 ……………………….  ½ jam
Xilol I  …………………………………… ½ jam
Xilol II …………………………………… ½ jam
Campuran xilol/parafin 1 : 9 dlm temperatur 58°C selama 24 jam.
  1. Infiltrasi : campuran xilol/parafin dibuang, diganti dengan parafin murni dalam temperatur tetap 58°C selama ± 24 jam.
  2. Penyelubungan (embedding) : parafin dibuang, diganti dengan parafin baru, setelah ± 1 jam, dibuat blok parafin berisi sampel dalam kotak/wadah.
  3. Pengirisan : blok sampel diiris menggunakan mikrotom dengan tebal 10 µm.
  4. Perekatan : irisan dilekatkan pada kaca objek yang sebelumnya diolesi campuran gliserin-albumin (1 : 1) dan air. Kemudian kaca objek tersebut disimpan di atas penghangat (slide warmer) dengan temperatur 45°C sampai pita parafin meregang dan air mengering.
  5. Pewarnaan : pewarnaan tunggal dengan safranin 1% dalam air. Berturut-turut kaca objek dimasukkan ke dalam bejana pewarnaan (staining jar) yang berisi larutan :
Xilol I ………………………………………… 5 menit
Xilol II ………………………………………... 5 menit
Etanol absolut I …………………….………. 3 menit
Etanol absolut II…………………………….. 3 menit
Etanol 95% …………………………………. 3 menit
Etanol 70% …………………………………. 3 menit
Etanol 50% …………………………………. 3 menit
Etanol 30% …………………………………. 3 menit
Akuades …………………………………….. 2 menit
Safranin ……………………………………... 24 jam
Akudes ……………………………………… 2 menit
Etanol 30% …………………………………. 3 menit
Etanol 50% …………………………………. 3 menit
Etanol 70% …………………………………. 3 menit
Etanol absolut I …………………………….. 3 menit
Etanol absolut II ……………………………. 3 menit
Xilol I ………………………………………… 5 menit
Xilol II ………………………………………..  5 menit
  1. Penutupan : irisan pada kaca objek ditutup dengan kaca penutup setelah sebelumnya diberi Canada balsam atau entellan. Preparat selanjutnya dikeringkan dalam oven atau slide warmer sampai entellan kering.
  2. Pemberian label yang meliputi nama bahan, orientasi irisan (melintang atau memanjang), tanggal pembuatan dll selanjutnya siap diamati.





IV.  HASIL DAN PEMBAHASAN
A.    Hasil Pengamatan
Pada praktikukm praparat paraffin tumbuhan ini, tidak ada hasil pengamatan karena kesalahan teknis, yakni kerusakan pada mikrotom.









kesalahan teknis



@asibatkah.co.id
 














B.     Pembahasan
            Praktikum pembuatan sediaan irisan jaringan hewan dengan metode parafin dapat diketahui bahwa dalam pembuatan preparat hewan lebih mudah untuk dibuat dan tidak memakan waktu yang panjang. Organ yang digunakan adalah organ hati. Hewan yang diambil organnya adalah katak, Tetapi ada sebagian organ yang gagal menjadi suatu preparat, hal ini mungkin disebabkan kurangnya ketelitian dan keterampilan pada saat mengiris block parafin saat menggunakan mikrotom, sehingga lembaran pita jaringan yang didapatkan terlalu tebal dan sulit diamati di bawah mikroskop. Selain itu, sebagian preparat tidak dapat dikenali dengan jelas bagian mana yang digunakan dari bahan percobaan karena pada saat proses pewarnaan, pencucian dan pencelupan sediaan ke larutan alkohol ada beberapa kertas label yang terlepas dari kaca objek. Sehingga hanya preparat yang kertas labelnya masih utuh yang dapat dikenali dengan benar.
            Organ yang digunakan tersebut harus diisolasi terlebih dahulu sebelum digunakan hal ini bertujuan agar organ yang dijadikan sediaan siap untuk melakukan berbagai tahap-tahap atau proses dalam percobaan. Proses pembuatan sediaan preparat setelah dibedah diambil organnya, kemudian dicuci dengan garam fisiologis agar organ tersebut tidak mengalami pembekuan. Setelah itu organ difiksasi digunakan larutan BNF selama ± 24 jam agar sel-sel dari organ tersebut mati namun strukturnya tidak rusak sehingga memudahkan langkah- langkah kedepannya.
Hati merupakan organ paling besar dan paling berat yang ada di dalam tubuh. Letaknya berada di bagian atas sebelah kanan abdomen dan di bawah tulang rusuk hati berperan sebagai organ utama dalam pembentukan darah., fungsi pokok hati adalah menyaring dan mendetoksifikasi segala sesuatu yang dimakan, dihirup, dan diserap melalui kulit dan menjadi pembangkit tenaga kimia internal, mengubah zat gizi makanan menjadi otot, energi, hormon, faktor pembekuan darah, dan kekebalan tubuh. Hati juga menyimpan beberapa vitamin, mineral (termasuk zat besi), dan gula, mengatur penyimpanan lemak dan mengontrol produksi serta ekskresi kolesterol. Empedu yang dihasilkan oleh sel hati membantu mencerna makanan dan menyerap zat gizi penting. Juga menetralkan dan menghancurkan substansi beracun serta memetabolisme alkohol, membantu menghambat infeksi, dan mengeluarkan bakteri dari aliran darah., fungsi hati meliputi enzimatik, hormonal, dan darah. Hati menyediakan enzim yang diperlukan untuk metabolisme, melakukan detoksifikasi, membentuk faktor pembekuan darah, dan beberapa hormon.
Fiksasi berfungsi untuk mempertahankan bentuk jaringan sedemikian rupa sehingga perubahan-perubahan bentuk atau struktur sel atau jaringan yang mungkin terjadi hanya sekecil mungkin. Selain itu fiksasi berguna untuk meningkatkan indeks bias jaringan sehingga jaringan dapat terwarnai dengan baik. Larutan fiksatif dibuang dan dicuci dengan alkohol 70 % selama 1 jam.
Kemudian didehidrasi dengan alkohol bertingkat mulai 80 %, 95 %, sampai alkohol tersebut absolut masing–masing selama 1 jam.
Hal ini dilakukan untuk proses fiksasi dengan membunuh sel tanpa mengubah posisi organel yang ada di dalamnya, dan juga untuk menghilangkan air yang ada dalam sel dan memperoleh hasil yang sempurna pada proses infiltrasi dan juga agar alkohol tersebut dapat menyerap air sedikit demi sedikit supaya dapat menjaga agar tidak terjadi perubahan yang tiba-tiba terhadap jaringan sehingga perubahan yang terjadi hanya sekecil mungkin. Selain itu fiksasi berguna untuk meningkatkan indeks bias jaringan sehingga jaringan dapat terwarnai dengan baik. Didealkoholasi, alkohol yang tadi dibuang dan diganti larutan secara berturut alkohol : xilol = 3 : 1, alkohol : xilol = 1 : 1 dan alkohol : xilol = 1 : 3 masing-masing selama 30 menit. Hal ini bertujuan untuk menggantikan tempat alkohol dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih menjelang proses penanaman sebelum proses penyayatan. Fungsi dari dehidrasi itu sendiri ialah untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan kimia tertentu.
Setelah tahapan fiksasi, organ didehidrasi dengan larutan alkohol bertingkat yang bertujuan untuk mengurangi kandungan air dari organ tersebut sehingga saat sudah menjai sediaan tidak akan cepat rusak. Selain itu untuk memudahkan peresapan parafin. Organ selanjutnya di clearing dengan larutan campuran antara xilol dan alkohol dengan perbandingan tertentu yaitu 3:1, 1:1, 1:3 dan xilol murni dengan tujuan untuk membersihkan sisa-sisa alkohol dari organ dan membantu proses penyerapan parafin. Tahapan berikutnya yaitu perendaman dalam parafin, tahapan ini biasanya dilakukan didalam oven agar saat organ dimasukkan dalam parafin, parafin tersebut tidak mudah membeku. Tahapan perendaman dalam parafin diulangi sebanyak 3 kali dengan tujuan agar parafin meresap sempurna dan pada saat pemotongan akan didapat hasil yang diinginkan. Selain itu tahapan perendaman dalam parafin yang sempurna juga turut mempengaruhi struktur organ yang digunakan. Organ yang sudah berada dalam block parafin akan dipotong dengan menggunakan mikrotom rotary, hasil yang diinginkan yaitu setebal 6 mikron, tahapan pemotongan memerlukan kesabaran dan ketelitian karena pada tahapan ini tidak bisa di predeksi kapan bahan yang ada dalam block parafin terpotong sempurna dan sesuai dengan ketebalan yang diinginkan. Pemotongan juga harus memperhatikan kumpulan paraffin yang terpotong dan membentuk gumpalan, karena bisa saja di dalam gumpalan tersebut terdapat potongan yang diinginkan. Organ yang telah dipotong kemudian akan mengalami tahapan pewarnaan dengan xilol 1 dan 2. Xilol digunakan sebelum pewarnaan selanjutnya yang menggunakan haematoksilin ehrlich agar saat pewarnaan dengan haematoksilin ehrlich dilakukan, warna yang dihasilkan akan sesuai dengan yang diinginkan sehingga hasil yang didapat akan memperlihatkan bagaimana penampang sebenarnya dari organ-organ tubuh.
Tahapan berikutnya adalah pencucian dengan akuades agar sisa-sisa warna yang menempel tidak sempurna bisa hilang. Kemudian perendaman dalam alkohol bertingkat diselingi dengan eosin dan dilanjutkan lagi dengan alkohol bertingkat, hal ini bertujuan untuk mengurangi kemungkinan lunturnya warna, untuk menghilangkan kandungan air yang mungkin saja masih tersisa setelah proses pencucian dan mencegah hal lainnya yang tidak diinginkan. Kendala yang dialami pada saat pembuatan sediaan irisan jaringa hewan dengan menggunakan metode parafin ini, salah satunya kesulitan atau kurangnya keterampilan dalam pembuatan preparat irisan saat pemotongan dengan menggunakan mikrotom. Ada beberapa jenis mikrotom yang dapat digunakan sebagai alat pemotong sediaan antara lain hand microtom, rocking microtom, rotary microtom, freezing microtom, dan sliding microtom. Sedangkan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah hand microtom. Hal inilah yang menyebabkan proses pemotongan yang paling sulit dilakukan karena dengan menggunakan mikrotom tangan seringkali praktikan sulit untuk mengukur ketebalan dari sediaan yang akan dipotong. Sehingga ada yang terlalu tebal dan ada yang terlalu tipis, hal ini menyebabkan irisan sediaan mudah hancur pada saat diletakkan di atas kaca objek. Beberapa kesukaran pada saat pemotongan sediaan parafin antara lain; pita tidak terbentuk, hal ini kemungkinan karena pisau yang tumpul; pita melengkung atau bengkok.
Hasil pengamatan yang didapatkan dari preparat atau sediaan irisan jaringan hewan dengan metode parafin ini belum dapat dijelaskan pada pembahasan ini karena telah terjadi kerusakan pada alat pemotongan parafin yakni mikrotom, sehingga parafin yang sudah dibuat belum dapat dipotong atau disayat, dan untuk memenuhi persyaratan ujian praktikum mikroteknik ini, maka laporan praktikum harus dibuat.

V. PENUTUP

A.    Kesimpulan
Adapun kesimpulan yang dapat ditarik pada praktikum pembuatan preparat metode parafin yaitu:
1.   Dalam pembuatan preparat hewan lebih mudah untuk dibuat dan tidak
      memakan waktu yang panjang.
2. Hasil pengamatan yang didapatkan dari preparat atau sediaan irisan jaringan hewan  dengan metode parafin ini belum diperoleh dengan baik karena terjadi kerusakan pada mikrotom

B.     Saran

            Saran yang dapat diajukan pada praktikum ini adalah sebaiknya alat diperbaiki terlebih dahulu sebelum praktikuk ini dilaksanakan, sehingga hasil pengamatan bisa diambil dan proses praktikum berjalan dengan lancar.
DAFTAR PUSTAKA


Kimball, 1992. Petunjuk Praktikum Mikroteknik Hewan. Fakultas Matematika dan Ilmu  Pengetahuan Alam Jurusan Biologi Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru.

Mcmanus, 1992. Metode Irisan Mikroteknik Hewan. Universitas Gajah Mada, Yogyakarta.

Perutz, 1978. Sel Darah Merah Pada Hewan, ITB, Bandung.

Rina M.S, 2010. Petunjuk Praktikum Teknik Laboratorium. Departemen Pendidikan Nasional Universitas Lambung Mangkurat Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Program Studi Biologi. Banjarbaru.

Santoso, H. B. 2002. Bahan Kuliah Teknik Laboratorium. Universitas Lambung
            Mangkurat, Banjarbaru.












LAPORAN PRAKTIKUM
MIKROTEKNIK
“Preparat Paraffin Hewan Irisan Organ


 









OLEH :

                                   STAMBUK       :        F1D1 10 043
                                   KELOMPOK   :         V (LIMA)
                                   ASISTEN          :        AGUNG JULIANTO, S.Si.

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HALUOLEO
KENDARI
2011

Tidak ada komentar:

Posting Komentar